Efeito da sobre-expressão da proteína translocadora (tspo) na infecção por Leishmania amazonensis

Abstract

Em trabalho realizado por nosso grupo foi demonstrado que Macrófagos (MΦ) de camundongos CBA controlam a infecção por L. major e são permissivos à L. amazonensis, sugerindo um papel importante destas células na resolução da infecção. Com intuito de identificar potenciais alvos envolvidos na infecção por Leishmania, utilizou-se uma abordagem proteômica, e dentre as proteínas identificadas, foi observado que a expressão da Proteína Translocadora (TSPO), está negativamente modulada na infecção por L. amazonensis. Assim, o presente trabalho visa avaliar o papel do TSPO na infecção por Leishmania. Inicialmente, a sequência do gene do TSPO foi obtida por RT-PCR a partir de RNAm de macrófagos de camundongo CBA infectados com L. major e clonada no pcDNA6.2/CEmGFP- DEST utilizando o sistema Gateway™. A clonagem do TSPO foi confirmada por sequenciamento e alinhamento com a sequência deste gene disponível no GenBank. Para obtenção de clones sobre-expressando o TSPO, células de linhagem macrofágica J774 foram submetidas à transfecção estável com os plasmídeos pcDNA6.2-TSPO e pcDNA6.2. As células transfectadas com o pcDNA6.2-TSPO apresentaram baixa taxa de sobrevivência em comparação com o controle. A fim de avaliar a funcionlidade do plasmídeo, células CHO foram transfectadas de forma transitória com o pcDNA6.2-TSPO e com imunofluorescência foi demonstrado que as células CHO pcDNA6.2-TSPO apresentaram marcação mais intensa que as CHO pcDNA6.2. Uma vez confirmada a funcionalidade do plasmídeo, foi realizada nova tentativa de transfecção estável de células J774 com pcDNA6.2-TSPO. Apesar destas células continuarem a apresentar alta letalidade, foram obtidos dois clones: J774 pcDNA6.2-TSPO clone 1 e J774 pcDNA6.2-TSPO clone 2. A expressão do TSPO mostrou-se aumentada 2,09 vezes nas J774 pcDNA6.2-TSPO clone 2 em comparação com J774 no entanto o clone 1 apresentou uma alteração da expressão do TSPO pouco significativa em comparação ao controle, por análise quantitativa de western-blot. Em seguida, os diferentes clones foram infectados com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e não foi observada diferença no percentual de células infectadas nem no número de parasita por células infectadas entre J774 pcDNA6.2-TSPO clone 1 e os controles. Entretanto, o clone 2 apresentou uma redução no número de células infectadas, no tempo de 6 horas. Essa redução não foi observada no tempo de 48 horas. Nossos dados sugerem que a sobre-expresão do TSPO reduz a fase inicial da infecção de células J774 por L. amazonensis. Visto que, foi realizada apenas um experimento em triplicata faz-se necessário o desenvolvimento de estudos adicionais para elucidar o papel desempenhado pelo TSPO na infecção por Leishmania.