Avaliação da ação antitumoral e imunomodulatória do flavonóide apigenina, extraído de cróton betulaster mull, em células d gliomas

Abstract

Gliomas são as neoplasias intracraniais mais comuns e malignas. O entendimento da biologia tumoral dos gliomas é um processo complexo e contraditório. Nossos estudos anteriores demonstram uma capacidade antitumoral e anti-angiogênica de flavonoides, além de potencial morfogênico e imunomodulador de células gliais não transformadas com liberação de TNF e NO. Neste trabalho objetivamos investigar as propriedades antitumorais e imunomodulatórias do flavonoide apigenina, extraído da Croton betulaster mull em culturas de células de glioma da linhagem C6. Inicialmente, investigamos os efeitos inibitórios e morfogênicos do flavonoide nas células de C6. Verificamos pelo teste de MTT e após coloração com azul de tripan, que a apigenina tem a capacidade em diminuir a viabilidade celular e a proporção de células viáveis de forma dose e tempo dependente. Ainda, após 72 h do tratamento das culturas com 100 μM da apigenina, uma significativa proporção de células apresentaram marcação positiva para anexina V (29,6%), caracterizando apoptose, e uma menor proporção marcação positiva para laranja de acridina (6%), caracterizando autofagia. Por outro lado, o flavonoide também induziu um acúmulo das células na fase G0/G1 do ciclo celular, além de inibir a migração celular desde 24 h após o tratamento. Ademais, a capacidade do flavonoide em induzir alterações morfológicas nas células de glioma foi também observada, caracterizada pela emissão de prolongamentos multipolares nas células e aumento da expressão de proteína astrocitária GFAP, em detrimento da proteína nestina, marcador de precursor neural. A ação imunomodulatória da apigenina também foi caracterizada por citometria em fluxo, sendo evidenciado uma diminuição da proporção de células expressando NFkB nenhuma alteração significativa em STAT3 e p-STAT3, ambas proteínas envolvidas na sinalização da resposta imune. Este efeito foi acompanhado de uma alteração no perfil de citocinas pró- e antiinflamatórias evidenciadas por ELISA. Nas culturas em condições controle os níveis de IL-10 (396 pg/ml) foram cerca de duas vezes superior àqueles de TNF (216 pg/ml), porém os níveis de IL-10 diminuíram para 132 pg/ml após exposição à uma dose subtóxica do flavonoide (50 μM); um aumento significativo de NO foi também verificado nestas condições. Os conjuntos destes resultados demonstraram que o flavonoide apigenina possui eficiente efeito sobre a viabilidade, crescimento e proliferação, das células de glioma, além de induzir diferenciação celular, e mudanças no perfil de citocinas envolvidas no processo regulatório da resposta imunológica, colocando esta droga como um possível candidato adjuvante para o tratamento dos tumores cerebrais malignos humanos.

Gliomas are the most common intracranial neoplasms and malignant. The understanding of tumor biology of gliomas is complex and contradictory. Our previous studies have shown an ability antitumor and anti-angiogenic flavonoids, morphogenic and immunomodulatory potential of glial cells not transformed with release of TNF and NO. In this work we aimed to investigate the immunomodulatory and antitumor properties of apigenin flavonoid extracted from Cronton betulaster mull in cell cultures of C6 glioma lineage. Initially, we investigated the inhibitory effects of flavonoid and morphogenesis in cell C6. We verified by MTT assay and after staining with trypan blue, that apigenin has the ability to reduce cell viability and the proportion of viable cells in a dose and time dependent. Even after 72 h of treatment of cultures with 100 mM of apigenin, a significant proportion of cells showed positive staining for Annexin V (29.6%), typical of apoptosis, and a minor proportion stained positive for acridine orange (6%) , featuring autophagy. Moreover, the flavonoid also induced an accumulation of cells in G0/G1 phase of the cell cycle, besides inhibiting cell migration from 24 h after treatment. Furthermore, the capability of the flavonoid in inducing morphological changes in glioma cells was also observed, characterized by the emission of extension multipolar cells and increased expression of GFAP astrocytic protein, rather than protein nestin, a marker of neural precursor. The immunomodulatory action of apigenin was also characterized by flow cytometry, as evidenced increased proportion of cells expressing the active form of phosphorylated STAT-3 (p-STAT), and decreased the proportion of cells expressing NFkB, both proteins involved in signaling immune response. This effect was accompanied by a change in the profile of pro-and anti-inflammatory evidenced by ELISA. In cultures in control conditions levels of IL-10 (396 pg / ml) were approximately twice those of TNF (216 pg / ml), but their levels of IL-10 decreased to 132 pg / ml after exposure to a subtóxica dose of flavonoid (50 mM), a significant increase of NO was also observed under these conditions. The sets of these results demonstrated that the flavonoid apigenin has efficient effect on the viability, growth and proliferation of glioma cells, and inducing cellular differentiation, and changes in the profile of cytokines involved in the regulatory process of immune response, placing this drug as an possible candidate for the adjuvant treatment of malignant human brain tumors.