DESENVOLVIMENTO DE PROTEÍNA SINTÉTICA QUIMÉRICA BASEADA EM TALE (TRANSCRIPTION ACTIVATOR-LIKE EFFECTOR) PARA APLICAÇÃO EM SISTEMA BIOSSENSOR DE DNA. 72f 2017

Abstract

As abordagens de Biologia Sintética possuem potencial de aumentar a produção de ferramentas diagnósticas adequadas para utilização na prática, como os biossensores de DNA. O controle dos sistemas biológicos permite o aprimoramento de tecnologias em uso e surgimento de novas tecnologias, como o diagnóstico molecular através da identificação de sequências específicas de DNA. A maioria dos métodos moleculares de diagnóstico de DNA se baseiam em hibridização. Contudo, atualmente, as proteínas ligadoras de DNA tem tido destaque, devido às suas numerosas vantagens. As principais vantagens são a identificação de sequências em DNA dupla-fita, eliminando o passo de desnaturação, e a alta especificidade pelo alvo. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma proteína sintética quimérica para aplicação em sistema biossensor de DNA que permitirá rápida identificação de uma sequência específica de DNA de Corynebacterium striatum, um importante patógeno emergente. Foi construída, neste estudo, uma proteína quimérica biossensora composta por: (I) um domínio de ligação ao DNA derivado de proteínas TALEs (proteínas efetoras do tipo ativadores transcricionais) o qual reconhece especificamente uma sequência de 18 pb de um gene único de C.striatum codificador de uma permease para transporte de ferro; combinado a (II) uma cromoproteína tsPurple (Tinsel Purple) para permitir detecção visual da sequência alvo. Para construção do gene codificador da proteína TALE específica, o gene específico de C. striatum foi analisado com a ferramenta Tal Effector Nucleotide Targeter (Cornell University) e uma sequência-alvo de 18pb foi definida. A construção de domínios TAL foi realizada utilizando a ferramenta GeneArtTM Perfect Match TAL (Thermo Scientific); o gene sintético encontra-se clonado no plasmídeo pTALE. Para construir as sequências gênicas quiméricas, foram desenhados primers de PCR para isolamento da sequência da tsPurple com a adição de sítios artificiais de restrição para EcoRI e BamHI; os produtos de PCR digeridos foram clonados no plasmídeo pTALE, downstream à sequência da TALE específica. Essas sequências fusionadas foram então sub-clonadas em um vetor de expressão pDESTTM17, através de recombinação utilizando tecnologia Gateway para expressão das proteínas quiméricas. A expressão da proteína quimérica foi induzida pela adição de 1mM de IPTG. A expressão da proteína quimérica foi confirmada através de análises de SDS PAGE 10% , que demonstraram a superexpressão da proteína esperada de 151kDa; além disso, foi observada a forte coloração roxa no precipitado bacteriano, em razão da funcionalidade da cromoproteína TsPurple.