Produção e caracterização da proteína c4299 de Trichuris trichiura como potencial imunomodulador

Abstract

Diversos estudos utilizando helmintos e suas moléculas têm se baseado na imunomodulação gerada por esses parasitos, na busca de potenciais terapêuticos contra doenças alérgicas, inflamatórias e autoimunes. Nesse contexto, através da tecnologia do DNA recombinante é possível produzir proteínas desses organismos para a elucidação e caracterização dessas moléculas frente a doenças. Objetivo: Identificar a proteína c4299 de Trichuris trichiura (Trichuris_c4299) no extrato proteico de vermes adultos desse helminto e expressar de forma recombinante a proteína Trichuris_c4299 para caracterização imunogênica. Metodologia: Para identificação de Trichuris_c4299 no extrato do verme adulto Trichuris trichiura foi realizado a análise do proteoma por meio de espectrometria de massa acoplado à cromatografia liquida (LC/MS/MS) utilizando o Q-ExactiveTM mass spectrometer. A caracterização da proteína foi realizada primeiramente in silico através de análises de bioinformática e, para isso, foram feitas predições das característica físico-químicas utilizando diferentes ferramentas. O gene codificante de Trichuris_c4299 foi sintetizado por empresa especializada e clonado no vetor pET28a(+) de expressão. A proteína recombinante foi expressa em sistema procarioto e purificada através de cromatografia de afinidade acoplada a uma coluna de níquel HisTrap FF. A imunoreatividade de Trichuris_c4299 recombinante foi analisada por meio de ensaios imunológicos como ELISA e Dot Blot utilizando soro de pacientes infectados com Trichuris trichiura. Resultados: A partir da análise do proteoma foi possível a identificação de Trichuris_c4299 no extrato proteico de machos e fêmeas adultos de Trichuris trichiura. A análise de bioinformática possibilitou a predição de diversas características úteis de Trichuris_c4299 para a sua produção recombinante em Escherichia coli. Além disso, foi padronizado a expressão e purificação da proteína recombinante, e observou-se que a mesma apresentou reatividade no teste de ELISA e de Dot Blot, mostrando assim potencial imunogênico. Conclusão: Nesse trabalho foi possível determinar a presença de Trichuris_c4299 no proteoma dos vermes adultos de Trichuris trichiura e efetuar a padronização da expressão e purificação dessa proteína. Adicionalmente, observou-se que Trichuris_c4299 apresenta imunoreatividade em soro de pacientes infectados. Sendo assim, essa molécula se mostra um novo alvo para futuras investigações acerca de imunomodulação, seja para doenças alérgicas ou para outras doenças inflamatórias e autoimunes.

Several studies using helminths and their molecules have been based on the immunomodulation generated by these parasites in the search for therapeutic potentials against allergic, inflammatory and autoimmune diseases. In this context, through recombinant DNA technology it is possible to produce proteins from these organisms for the elucidation and characterization of these molecules against diseases. Objective: To identify the c4299 protein of Trichuris trichiura (Trichuris_c4299) in the protein extract of adult worms of this helminth and to recombinantly express the Trichuris_c4299 protein for immunogenic characterization. Method: For the identification of Trichuris_c4299 in the extract of the adult Trichuris trichiura worm, proteomic analysis was performed by mass spectrometry coupled to liquid chromatography (LC / MS / MS) using the Q-ExactiveTM mass spectrometer. The characterization of the protein was first performed in silico through bioinformatics analyzes and, for this, predictions were made of the physical-chemical characteristics using different tools. The gene encoding Trichuris_c4299 was synthesized by a specialized company and cloned into expression vector pET28a(+).The recombinant protein was expressed in prokaryotic system and purified by affinity chromatography coupled to a HisTrap FF nickel column. Recombinant Trichuris_c4299 immunoreactivity was analyzed by immunological assays such as ELISA and Dot Blot using serum from patients infected with Trichuris trichiura. Results: From the proteomic analysis it was possible to identify Trichuris_c4299 in the protein extract of adult males and females of Trichuris trichiura. Bioinformatics analysis enabled the prediction of several useful features of Trichuris_c4299 for its recombinant production in Escherichia coli. In addition, expression and purification of the recombinant protein were standardized, and it was observed that it showed reactivity in the ELISA and Dot Blot test, thus showing immunogenic potential. Conclusion: In this work it was possible to determine the presence of Trichuris_c4299 in the proteome of the adult worms of Trichuris trichiura and to carry out the standardization of expression and purification of this protein. In addition, Trichuris_c4299 has been shown to exhibit immunoreactivity in serum of infected patients. Therefore, this molecule is a new target for future research on immunomodulation, whether for allergic diseases or for other inflammatory and autoimmune diseases