Determinação de marcadores da infecção por Corynebacterium pseudotuberculosis em caprinos: métodos clássicos, ressonância magnética nuclear e quimiometria

Abstract

A Linfadenite Caseosa (LC), doença infecciosa causada pela bactéria Gram positiva Corynebacterium pseudotuberculosis em caprinos e ovinos, é altamente prevalente em rebanhos de pequenos ruminantes mundialmente. Diversos prejuízos econômicos, representados pela diminuição do valor do couro, condenação de carcaças e falhas reprodutivas, já foram associados com a ocorrência da doença. As técnicas atualmente disponíveis de diagnóstico clínico e laboratorial da doença carecem de disponibilidade mercadológica ou de sensibilidade e, com isso, animais infectados podem permanecer no rebanho servindo de fonte de infecção para os outros animais. A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e a quimiometria são técnicas que podem identificar metabólitos não detectáveis por técnicas clássicas de diagnóstico laboratorial. O presente estudo teve como objetivo determinar marcadores da infecção por C. pseudotuberculosis em caprinos utilizando métodos clássicos (parâmetros clínicos, hematológicos, bioquímicos), sorológicos, RMN e quimiometria. Foi utilizado um rebanho de 173 caprinos da raça Canindé, dos quais foram coletadas as amostras de sangue e soro para as análises. Os animais foram classificados como não infectados controle (C), assintomáticos (A) e sintomáticos (S), de acordo com o isolamento microbiológico, a partir do conteúdo de lesões caseosas e ensaio sorológico (ELISA). Foram realizados hemogramas completos, ensaios de bioquímica clínica para determinação da concentração de compostos séricos; análises de 1H RMN por NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectrosopY) e CPMG (Carr-Purcell Meiboom-Gill) e quimiometria por Análise Discriminante por Quadrados Mínimos Parciais (PLS-DA) para verificação e possíveis biomarcadores para a doença. Foi observada alta disseminação de infecção por C. pseudotuberculosis nesse rebanho, com 86,13% de animais positivos, sendo desses 74,57% assintomáticos e 11,56% sintomáticos. Nas análises de hemograma e leucograma, houve diferença estatística no nível de ureia sérica no grupo de assintomáticos maior do que animais não infectados. Na avaliação de 62 amostras de soro por RMN e quimiometria, as técnicas empregadas foram satisfatórias na discriminação dos grupos de animais, sendo também complementares e confirmatórias entre si, demonstrando possíveis biomarcadores para LC. Foram identificados 20 metabólitos de interesse pela técnica de NOESY e 29 por CPMG, abrindo-se possibilidades promissoras para estabelecimento das técnicas de RMN e quimiometria como adequadas para método diagnóstico da doença, tanto pelas vantagens das técnicas quanto pelos resultados aqui reportados pela primeira vez em caprinos.

ABSTRACT Caseous lymphadenitis (CL), an infectious disease caused by the Gram-positive bacterium Corynebacterium pseudotuberculosis in goats and sheep, is highly prevalent in small ruminant herds worldwide. Several economic losses, represented by the decrease in the value of leather, condemnation of carcasses and reproductive failures, have already been associated with the occurrence of the disease. Currently available techniques for clinical and laboratory diagnosis of the disease lack market availability and/or sensitivity and, therefore, infected animals can remain in the herd, serving as a source of infection for other animals. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and chemometrics are techniques that can identify metabolites not detectable by classical laboratory diagnostic techniques. The present study aimed to determine markers of C. pseudotuberculosis infection in goats using classical methods (clinical, hematological, biochemical), serological, NMR and chemometry. A herd of 173 Canindé goats was used, from which blood and serum samples were collected for analysis. The animals were classified as uninfected control (C), asymptomatic (A) and symptomatic (S), according to microbiological isolation, based on the content of caseous lesions and serological assay (ELISA). Complete blood counts, clinical biochemistry tests were performed to determine the concentration of serum compounds; 1H NMR analyzes NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectrosopY) and CPMG (Carr-Purcell Meiboom-Gill) and Partial Least Square Discriminant Analysis chemometry (PLS-DA) for verification and possible biomarkers for the disease. A high dissemination of the infection by C. pseudotuberculosis was observed in the herd, with 86.13% of positive animals, being 74.57% asymptomatic and 11.56% symptomatic. In the hemogram and clinical biochemistry analyses, the only statistical difference found was the higher level of serum urea in asymptomatic individuals than in non-infected animals. In the evaluation of 62 serum samples by NMR, the techniques employed were satisfactory in discriminating the groups, being also complementary and mutually confirming, demonstrating possible biomarkers for CL. Twenty metabolites of interest were identified by NOESY and 29 by CPMG, opening up promising possibilities for the establishment of NMR and chemometric techniques as CL suitable diagnosis methods, both because of the advantages of the techniques and the results reported herein for the first time in goats.